Tạo dẫn xuất và xác định cấu hình tuyệt đối của một số aldose bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

 

Mở đầu

     Các gốc đường (aldose) là một phần hết sức phổ biến trong cấu trúc của nhiều các nhóm hợp chất tự nhiên như saponin, polysaccharide, glycoside... Mặc dù có thể sử dụng độ quay cực để xác định cấu hình của các aldose nguyên chất, nhưng trong thực tế, lượng hoạt chất thu được thường không đủ để tiến hành thủy phân, tinh chế và đo đạc thông số này. Các đồng phân đối quang của aldose hầu như không có sự khác nhau về thời gian lưu khi phân tích trên cột pha đảo C₁₈ thông thường, hơn nữa, các phân tử này cũng không dễ phát hiện được trên đầu dò UV hoặc khối phổ. Việc tách và phân tích aldose có thể tiến hành trên cột sắc ký tách đồng phân đối quang (chiral column chromatography) [1] tuy nhiên hạn chế về khả năng phát hiện các phân tử này vẫn rất khó giải quyết. Kỹ thuật điện di mao quản (capillary electrophoresis) cũng đã được ứng dụng để phân biệt cấu hình của các aldose [2] nhưng kỹ thuật này đòi hỏi những thiết bị chuyên dụng và không phổ biến trong các phòng thí nghiệm hóa hữu cơ. Do đó, một phương pháp sử dụng các hóa chất và thiết bị phổ thông trong phòng thí nghiệm để xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường sẽ giúp đơn giản hóa quá trình giải quyết các cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ. Phương pháp chuyển hóa aldose thành các dẫn xuất có khả năng phân tách và nhận dạng trên HPLC ghép nối với đầu dò UV đã được Tanaka và cộng sự phát triển và công bố vào năm 2007 [3]. Tới năm 2012, phương pháp này tiếp tục được thử nghiệm trên hệ thống HPLC-MS bởi Wang và cộng sự [4]. Nhìn chung đây là một phương pháp hiệu quả và khá đơn giản để xác định cấu hình của các gốc đường trong các hợp chất tự nhiên.

Cơ sở của phương pháp

Các đồng phân đối quang của aldose khi phản ứng với L-cysteine methyl ester và phenyl isothiocyanate hoặc o-tolyl isothiocyantate trong dung môi pyridine khan để tạo ra các cặp dẫn xuất arylthiocarbamate. Các dẫn xuất này chứa vòng thơm và nhiều nhóm mang màu khác nên hấp thụ bước sóng UV 250-260 nm và có thể dễ dàng phát hiện và phân biệt trên TLC, đầu dò UV hoặc MS. Mặt khác, do dẫn xuất của cặp đồng phân D/L là đồng phân dia của nhau nên thời gian lưu của chúng cũng khác biệt đáng kể trên HPLC.  Ví dụ dưới đây sẽ minh họa cho phản ứng tạo dẫn xuất của D/L-glucose

 

Hình 1. Sơ đồ phản ứng tạo dẫn xuất của D/L-glucose

Thực nghiệm

Quy trình tạo dẫn xuất và phân tích đối với các chất chuẩn đối chiếu được Tanaka và cộng sự mô tả như sau [3]: Cân khoảng 1 mg aldose và 120 μL L-cysteine methyl ester trong pyridine. Sau khi trộn đều, hỗn hợp phản ứng được ủ trong một giờ ở 60 °C rồi thêm 160 μL phenyl isothiocyanate và tiếp tục ủ ở 60 °C thêm 60 phút nữa. Hỗn hợp phản ứng được bơm thẳng lên hệ thống HPLC với cột C₁₈ và tín hiệu được phát hiện trên UV detector ở bước sóng 250 nm. Quy trình này cũng được Wang và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu của mình nhưng ở nhiệt độ phản ứng cao hơn (90 °C) và pha loãng hỗn hợp sản phẩm phản ứng trước khi tiêm vào hệ thống UPLC-MS [4]. Hỗn hợp chứa dẫn xuất arylthiocarbamate thường không bền ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên, khi bảo quản ở nhiệt độ -20 °C các chất này có thể tồn tại trong tám tháng mà không có sự thay đổi đáng kể về thành phần và cấu trúc [4].

Đối với các hợp chất glycoside, trước hết, thủy phân chất phân tích trong dung dịch HCl 2M ở 90 °C trong 2 giờ, sau đó trung hòa hỗn hợp phản ứng với nhựa trao đổi ion Amberlite IRA400 để loại bỏ acid dư trong sản phẩm . Hỗn hợp phản ứng được sấy đông cô, sau đó đem phần cặn hòa tan trong 100 μL pyridine đã hòa tan sẵn 0,5 mg L-cystein methyl ester hydrochloride và ủ trong 1 giờ ở 60 °C. Tiếp đó, thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,5 mg phenyl isothiocyanate và tiếp tục ủ ở 60 °C thêm 60 phút nữa. Hỗn hợp phản ứng được bơm thẳng lên hệ thống HPLC với cột C₁₈ và tín hiệu được phát hiện trên UV detector ở bước sóng 250 nm [3]. Wang và cộng sự đã cải tiến quy trình thủy phân hoạt chất bằng cách sử dụng dung dịch NH₄OH 9M để trung hòa hỗn hợp sau khi đun với HCl, đồng thời sử dụng khí N₂ để sấy khô hỗn hợp thay cho quá trình đông khô [4].

Kết quả và bàn luận

Trong nghiên cứu của Tanaka và cộng sự, mười một cặp đồng phân đối quang của các aldose đã được sử dụng để tạo dẫn xuất và so sánh về thời gian lưu trên hệ thống HPLC-UV. Kết quả cho thấy thời gian lưu của các dẫn xuất với mỗi đồng phân đối quang chênh lệch từ 0,5–13 phút (Bảng 1). Chênh lệch thời gian lưu giữa dẫn xuất của hai đồng phân D/L-galactose là khá nhỏ (khoảng 29 giây). Các dẫn xuất của D/L - glucose, xylose hoặc arabinose có chênh lệch thời gian lưu khoảng 1,3-1,4 phút, trong khi giữa hai đồng phân của apiose hoặc rhamnose có thể chênh nhau 12,9 - 13,6 phút về thời gian lưu khi phân tích trên HPLC-UV [3]. Những chênh lệch này là đủ lớn để có thể phân biệt hai đồng phân hoặc phân tích so sánh giữa mẫu thực và mẫu đối chiếu trên hệ thống HPLC ghép nối đầu dò UV.

Bảng 1. So sánh thời gian lưu các dẫn xuất arylthiocarbamate

Aldose	Cấu hình	tR (min)	Δt
Hexose
Glucose	D	17,48	1,33
	L	16,15
Mannose	D	11,2	6,21
	L	17,41
Galactose	D	15,45	0,49
	L	15,95
Rhamnose	D	15,85	13,61
	L	29,47
Fucose	D	23,76	2,41
	L	26,17
Glucuronic acid	D	18,17	0,53
	L	17,64
N-Ac-glucosamine	D	11,04	3,89
	L	14,93
Pentose
Arabinose	D	20,83	1,31
	L	19,52
Xylose	D	20,36	1,43
	L	18,93
Apiose	D	28,57	12,88
	L	15,69
Ribose	D	20,96	6,15
	L	14,81

 

Trong khi đó, nghiên cứu của Wang và cộng sự, sử dụng hệ thống phân tích UPLC-MS, đã phân biệt được dẫn xuất của 16 aldose thuộc ba phân nhóm là hexose, deoxy-hexose và pentose [4]. Phân nhóm hexose có mảnh ion phân tử đặc trưng m/z 455 gồm dẫn xuất của L-allose; L-glucose; D-galactose; L-galactose; D-glucose và D-allose (Hình 2). Dẫn xuất của D và L-allose có mức chênh lệch thời gian lưu lên tới gần 8 phút, trong khi các dẫn xuất của D/L- glucose và D/L-galactose cũng có thời gian lưu chênh nhau từ 1-2 phút. Tương tự như vậy, các cặp đồng phân đối quang của các aldose thuộc phân nhóm deoxy-hexose m/z 439 gồm 2-deoxy-D-glucose; 2-deoxy-D-galactose; D-fucose; L-fucose; 6-deoxy-D-glucose và L-rhamnose; và phân nhóm pentose m/z 425 gồm L-xylose; D-xylose; L-arabinose, D-arabinose cũng lần lượt được phân biệt (Hình 2).

 

Hình 2. Sắc ký đồ 16 dẫn xuất của các aldose. Phân nhóm hexose m/z 455 gồm 1, L-allose; 2, L-glucose; 3, D-galactose; 4, L-galactose; 5, D-glucose và 6, D-allose; phân nhóm deoxy-hexose m/z 439 gồm 7, 2-deoxy-D-glucose; 8, 2-deoxy-D-galactose; 9, D-fucose; 10, L-fucose; 11, 6-deoxy-D-glucose và 12, L-rhamnose; phân nhóm pentose m/z 425 gồm 13, L-xylose; 14, D-xylose; 15, L-arabinose và 16, D-arabinose) [4]

Trong các công bố trên, các nhóm tác giả cũng áp dụng phương pháp tạo dẫn xuất để xác định cấu hình của gốc đường trong các phân tử hợp chất tự nhiên như 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propene-3-O-(4-O-α-arabinopyranosyl)-β-glucopyranoside [3], cauloside G hoặc ciwujianoside A1 [4]. Để làm được điều này, các gốc đường cần được thủy phân về dạng monosaccharide, sau đó, trung hòa acid dư và loại bỏ hoàn toàn nước trong hỗn hợp trước khi tạo dẫn xuất. Phân tích sản phẩm phản ứng ở cùng điều kiện sắc ký với dẫn xuất của aldose nguyên chất và so sánh về thời gian lưu cho phép xác định được chính xác cấu hình của gốc đường.

 

Lời kết

Cho tới thời điểm bài viết này được biên soạn, công bố của Tanaka đã được trích dẫn tới 694 lần (theo thống kê trên Google Scholar), cho thấy phương pháp phân tích trên đã được sử dụng hết sức rộng rãi. Phương pháp tạo dẫn xuất được trình bày ở trên được thực hiện đơn giản, có độ tin cậy đã được kiểm chứng, độ nhạy cao nên đòi hỏi lượng mẫu nhỏ, rất thích hợp để xác định cấu hình tuyệt đối của các gốc đường trong trường hợp phân lập được hoat chất ở lượng nhỏ, điển hình là các hợp chất tự nhiên.

Tài liệu tham khảo

1. Masateru Ono, Kanna Oishi, Hiroaki Abe, Chikako Masuoka, Masafumi Okawa, Tsuyoshi Ikeda and Toshihiro Nohara, 2006, New Iridoid Glucosides from the Aerial Parts of Verbena brasiliensis, Chemical and Pharmaceutical Bulletin,  54(10), pp. 1421-1424.

2. Christian R. Noe and Jerome Freissmuth, 1995, Capillary zone electrophoresis of aldose enantiomers: separation after derivatization with S-(−)-1-phenylethylamine, Journal of Chromatography A,  704(2), pp. 503-512.

3. Takashi Tanaka, Tatsuya Nakashima, Toshihisa Ueda, Kenji Tomii and Isao Kouno, 2007, Facile Discrimination of Aldose Enantiomers by Reversed-Phase HPLC, Chemical and Pharmaceutical Bulletin,  55(6), pp. 899-901.

4. Yan-Hong Wang, Bharathi Avula, Xiang Fu, Mei Wang and Ikhlas A. Khan, 2012, Simultaneous Determination of the Absolute Configuration of Twelve Monosaccharide Enantiomers from Natural Products in a Single Injection by a UPLC-UV/MS Method, Planta Med,  78(08), pp. 834-837.